10 tế bào có thẩm quyền e coli hàng đầu năm 2022

Ấn Độ J Microbiol. 2018 tháng 12; 58 (4): 448 Từ456. 2018 Dec; 58(4): 448–456.

trừu tượng

Các hệ thống chuyển đổi hiệu quả, thông lượng cao quyết định sự thành công của nhân bản gen và phân tích chức năng. Trong số các yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến hệ thống chuyển đổi này, khả năng năng lực của các tế bào đích là một trong những yếu tố quan trọng nhất. Chúng tôi đã tìm thấy các peptide kháng khuẩn LFCIN-B có thể làm tăng tính thấm của màng tế bào và tính chất kháng khuẩn gây chết người của chúng có thể bị ức chế bởi nồng độ Ca2+ và MN2+ cao vừa phải. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập một phương pháp tiện lợi và nhanh chóng (CRM) bằng cách thêm nồng độ nhỏ (0,35 & Nbsp; Mg/L) và nồng độ MNCL2 cao vừa phải (50 & NBSP; MM) và CaCl2 (30 & NBSP; MM) trong bộ đệm biến đổi. Hiệu suất chuyển đổi của các tế bào E. & NBSP; coli (DH5α, JM109 và Top10) được điều chỉnh bởi CRM có thể so sánh với điện hóa để chuyển đổi plasmid (3,1 ± 0,3 × 109 CFU/Muffg). Không giống như các tế bào có thẩm quyền được điều chế bằng các phương pháp hóa học khác, những phương pháp thu được bằng phương pháp CRM cực kỳ có khả năng nhận các đoạn DNA kích thước lớn hơn (> 5000 & NBSP; BP) vào các vectơ plasmid. Các tế bào E. & NBSP; Các tế bào coli được điều chế bằng phương pháp CRM đặc biệt hữu ích cho hầu hết các thí nghiệm chuyển đổi hiệu quả cao trong điều kiện phòng thí nghiệm bình thường.

Từ khóa: Biotransformation, tế bào có thẩm quyền, hiệu quả chuyển đổi cao, nhân bản phân tửBiotransformation, Competent cells, High transformation efficiency, Molecular cloning

Giới thiệu

Chuyển đổi liên quan đến việc đưa DNA ngoại sinh vào vi khuẩn thụ thể để tạo ra các đặc điểm di truyền mới. Đây là kỹ thuật cơ bản và quan trọng nhất trong nhân bản phân tử, đó là quá trình cô lập một đoạn DNA mục tiêu và tạo ra nhiều bản sao của nó [1]. Có hai loại phương pháp biến đổi: hóa học và vật lý [2, 3]. Phương pháp chuyển đổi vật lý là điện di. Nó có hiệu suất biến đổi cao lên tới 109 chất biến đổi 10101010/μg DNA trong E. & NBSP; coli [2]. Một số nghiên cứu khác cũng đã báo cáo chuyển đổi hiệu quả cao thông qua điện hóa trong Agrobacterium Tunrefaciers/Rhizobium và Bacillus Brevis [4 Ném7]. Tuy nhiên, thiết bị chuyên dụng đắt tiền là cần thiết để điện di, và không phải tất cả các phòng thí nghiệm đều có thể cung cấp nó. Chuyển đổi hóa học rất được hoan nghênh trong các thí nghiệm nhân bản phân tử vì nó đơn giản và không tốn kém. Phương pháp hóa học cổ điển là phương pháp canxi clorua (phương pháp CACL2) được xuất bản bởi Mandel và Higa, đây vẫn là một lựa chọn phổ biến cho nhiều phòng thí nghiệm [8]. Vai trò của Ca2+ trong phương pháp này là phá hủy mảng lipid trên màng tế bào và tạo thành một phức hợp với poly-hydroxybutrate và phosphate đa cơ thể trên màng tế bào để tạo điều kiện cho sự xâm nhập của DNA ngoại sinh và hiệu quả biến đổi là 105. Các chất biến đổi/μg DNA được chứng minh là đủ cho phần lớn mục đích nhân bản [9, 10]. Mặc dù phương pháp canxi clorua là thuận tiện và có thể lặp lại, việc chuẩn bị các tế bào có thẩm quyền tương đối tốn thời gian và đòi hỏi sức mạnh đáng kể. Quan trọng hơn là hiệu quả chuyển đổi thấp hơn nhiều so với điện hóa, điều này làm cho nó không phù hợp với một số thí nghiệm nhân bản phân tử như xây dựng các thư viện cDNA phức tạp cao với chi tiêu tối thiểu của mRNA [11]. Một số lượng lớn các nghiên cứu đã nỗ lực để thiết lập một phương pháp nhanh chóng và hiệu quả để chuẩn bị các tế bào E. & NBSP; coli có khả năng như vậy với tần số chuyển đổi cực kỳ cao, đáp ứng các yêu cầu của các thí nghiệm nhân bản phân tử hiện đại [3, 12, 16] . Có hai con đường để cải thiện giao thức chuẩn bị, thứ nhất là đơn giản hóa các bước và thời gian chuẩn bị và lần thứ hai là tăng tần số biến đổi của các tế bào có khả năng hóa học [11, 17. Tuy nhiên, không có phương pháp nào được trích dẫn ở trên có thể cung cấp các tế bào E. & NBSP; coli có thẩm quyền đặc biệt hữu ích để nhận các đoạn DNA mục tiêu lớn vào vectơ plasmid. Các tế bào như vậy là cơ sở cho hầu hết các thí nghiệm phân tử như phân tích nội địa hóa dưới tế bào, xét nghiệm hai giống nấm men, phân tích miễn dịch huỳnh quang và các yếu tố tương tự.

Ngày càng có nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng peptide kháng khuẩn có thể tiêu diệt các vi sinh vật bằng cách phá hủy màng tế bào của vi sinh vật và tác dụng của một số peptide kháng khuẩn, như tăng tính thấm của màng tế bào, không gây chết người đối với E. & NBSP; . Vì lý do này, chúng tôi đã cải thiện giao thức được mô tả bởi Inoue [11], là một trong những phương pháp hóa học tốt nhất hiện có, bằng cách thêm nồng độ nhỏ của LFCIN-B, một peptide kháng khuẩn được tìm thấy ở động vật có vú [25] để thiết lập phương pháp cho Chuẩn bị các tế bào như vậy cả hiệu quả trong plasmid và biến đổi DNA mục tiêu lớn.

Materials and Methods

Bacterial Strains, Plasmids and Chemicals

Three strains of E. coli (DH5α, TOP10 and JM109) were used in this study to prepare competent cells. The commercial competent cells DH5α and JM109 were purchased from Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd, commercial competent cells TOP10 were purchased from TIANGEN BIOTECH (Beijing) Co., Ltd. The pUC19 plasmids and restriction enzymes used in our laboratory were purchased from New England Biolabs (USA). The pGEM-Teasy vector were purchased from Promega Corporation, an affiliate of Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd. The other chemicals used in this study were purchased from Sigma-Aldrich Co. LLC or Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

Media for Bacterial Growth

For LB fluid medium, 1% Bacto–Tryptone (10 g/L), 0.5% Bacto–Yeast Extract (5 g/L), 0.5% NaCl (5 g/L), adjust the pH to 7.5, autoclave to sterilize. For LB plates, 1.5% Bacto-agar (15 g/L) was added prior to autoclaving. For S.O.C. fluid medium, 2% Bacto–Tryptone (20 g/L), 0.5% Bacto–Yeast Extract (5 g/L), 0.05% NaCl (0.5 g/L), 2.5 mM KCl (0.186 g/L), 1 mM MgCl2 (0.95 g/L), 10 mM MgSO4 (1.2 g/L), 75 mM (13.6 g/L) glucose, adjust the pH to 7.0, autoclave to sterilize. For S.O.B fluid medium, 2% Bacto–Tryptone (20 g/L), 0.5% Bacto–Yeast Extract (5 g/L), 0.05% NaCl (0.5 g/L), 2.5 mM KCl (0.186 g/L), 1 mM MgCl2 (0.95 g/L), adjust the pH to 7.0, autoclave to sterilize.

The Competent Cell Preparation Methods and Transformation Methods

There were three methods for competent cell preparation in this study. One was CaCl2 method [8, 26], the second was Inoue method [11], and the last one was our improve method (CRM). All these three competent cells were used for heat shock transformation, the details for preparation and transformation were described as follow:

CaCl2 Method [8, 26]

The CaCl2 method using to prepare competent cells and transformation were both followed the protocols described by Sambrook [26].

Inoue Method [11]

The transformation buffer (TB) was made of 10 mM Pipes, 55 mM MnCl2, 15 mM CaC12 and 250 mM KCI, the pH was adjusted to 6.7 with KOH. And then, the solution was sterilized by filtration through a preripsed 0.45 µm filter unit and stored at 4 °C. All salts were added as solids. Frozen stock E. coli competent cells were thawed, streaked on an LB agar plate, and cultured overnight at 37 °C. The large (diameter 2–3 mm) colonies were isolated and inoculated to 250 mL of SOB medium in a 2-L flask, and grown to an OD6oo of 0.6 at 18 °C, with vigorous shaking (200–250 rpm). The flask was removed from the incubator and placed on ice for 10 min. The culture was transferred to a 500 mL erlenmeyer flasks and centrifuged at 3000 rpm for 10 min at 4 °C. Discard the supernatant and resuspend the pellet in 80 mL of ice-cold TB, and then incubated in an ice bath for 10 min, and then centrifuge as above. Discard the supernatant and resuspend the pellet gently in 20 mL of DMSO-TB buffer [final concentration of DMSO (m/v) was 7%]. After incubating in an ice bath for 10 min, the cell suspension was dispensed by 1–2 mL into tissue-culture cell-freezing tubes and immediately chilled by immersion in liquid nitrogen. The frozen competent cells were stored in − 78 °C or used for transformation immediately.

Usually, 1–5 µL plasmid (ligation product) was added into the competent cells for transformation, and then the cells were incubated in an ice bath for 30 min. They were then heat-shoked without agitation at 42 °C for 30 s and transferred to an ice bath. After 0.8 mL of SOC was added, the tubes were placed in a 37 °C incubator and shaken vigorously for 1 h. A desired portion of the mixture was poured on the LB plate with ampicillin (final concentration 100 µg/mL). Colonies were counted after overnight incubation at 37 °C.

CRM Method (Our Improved Method)

The transformation buffer (TB) was made of 10 mM Pipes, 50 mM MnCl2, 30 mM CaC12, 250 mM KCl and 0.35 mg/L LFcin-B, the pH was adjusted to 6.7 with KOH. The solution was also sterilized by filtration through a 0.45 µm filter unit and stored at 4 °C.

Streak a LB agar plate with E. coli cells from a frozen stock. Incubate the plate upside down at 37 °C until colonies appear. Inoculate one colony into 500 mL S.O.C. liquid medium in a 1 L flasks, incubate at 18 °C with shaking at 100 rpm overnight until the OD600 reaches 0.6. Incubate cells at ice for 10 min, and then centrifuge the cells at 2500 rpm for 10 min at 4 °C. Discard the supernatant and resuspend the pellet in 16 mL TB. Incubate cells at ice for 10 min, and then centrifuge as above. Discard the supernatant and resuspend the pellet in 8 mL TB, and then centrifuge the cells at 2500 rpm for 10 min at 4 °C. Discard the supernatant and resuspend the pellet in 4 mL DMSO-TB buffer [final concentration of DMSO (m/v) was 7%]. Incubate the cells at ice for 30 min. Aliquot 100 μL into individual 1.5 mL tubes. Frozen in liquid nitrogen immediately and stored at − 78 °C or used for transformation immediately.

Để chuyển đổi, bước đầu tiên là nhẹ nhàng trộn 1 155 & nbsp; plasmid (sản phẩm thắt) với các tế bào có thẩm quyền. Thứ hai, ủ hỗn hợp trên băng cho 30 & nbsp; tối thiểu ngay lập tức. Hỗn hợp sau đó được phát nhiệt mà không bị khuấy động ở 42 & nbsp; ° C cho 30 & nbsp; s và được chuyển sang băng cho 2 & nbsp; min ngay lập tức. Sau 500 & nbsp; μl lb môi trường chất lỏng được thêm vào hỗn hợp, chúng ủ ở 37 & nbsp; ° C khi lắc ở 200 & nbsp; RPM cho 1 & nbsp; h. Một phần mong muốn của hỗn hợp được đổ vào tấm LB với ampicillin (nồng độ cuối cùng 100 & nbsp; Các thuộc địa được tính sau khi ủ qua đêm ở 37 & nbsp; ° C.

Thí nghiệm điện hóa, sàng lọc điểm trắng trắng và PCR vi khuẩn riêng lẻ được thực hiện theo giao thức được mô tả bởi Sambrook [26].

Tính toán hiệu quả chuyển đổi

Hiệu quả biến đổi (TE) được định nghĩa là số lượng CFU (đơn vị hình thành khuẩn lạc) được sản xuất bởi 1 & nbsp;

TC (CFU) = thenumberofbacteriacolonies × pha loãng

Và sau đó hiệu quả chuyển đổi (TE) được tính toán theo phương trình sau:

TE (CFU/μg) = tcplasmidDNA (g)

Trong nghiên cứu này theo các phương pháp, tỷ lệ pha loãng cho phương pháp Inoue và CRM là 5 × 106 lần, đối với phương pháp CaCL2 là 1 × 106 lần. Tỷ lệ pha loãng cho các tế bào có thẩm quyền thương mại cũng được tính là 500.000 lần trong nghiên cứu này. Để tính toán hiệu quả chuyển đổi, DNA plasmid 2 & nbsp; μL (500 & nbsp; ng/μl) đã được thêm vào trong các tế bào có thẩm quyền 100 & nbsp; Có ba lần lặp lại cho mỗi xét nghiệm.

Phân tích tính thấm của màng tế bào

Xét nghiệm NPN được sử dụng để phát hiện tính thấm màng ngoài của E. coli [27]. Tế bào E. coli trong pha logarit trong môi trường LB (với mật độ quang của OD600 là 0,4) đã được thu thập và nối lại với bình thường & nbsp; nước muối. Đến 1 & nbsp; ML thể tích vi khuẩn trong một cuvette thạch anh, NPN (N-phenyl-1-naphthylamine) đã được thêm vào (nồng độ cuối cùng: 10 & nbsp; Nồng độ khác nhau của LFCIN-B được thêm vào để tạo nồng độ của chúng 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 và 0,5 & Nbsp; Mg/L. Một máy quang phổ huỳnh quang (PE LS45) đã được sử dụng để ghi lại huỳnh quang mỗi 30 & NBSP; Min, bước sóng kích thích và phát xạ được đặt ở mức tương ứng 350 và 429 & NBSP; NM. Các xét nghiệm kiểm soát đã được thực hiện để xác minh rằng huỳnh quang tăng cường là do sự hấp thu NPN của vi khuẩn.

Tính thấm màng bên trong của E. coli được xác định bằng cách đo sự giải phóng hoạt động β-galactosidase vào môi trường nuôi cấy bằng cách sử dụng ONPG (Ortho-nitrophenyl-β-galactoside) làm chất nền [27]. β-galactosidase là một loại enzyme cảm ứng E. coli điển hình nằm trong màng tế bào vi khuẩn và có khả năng thủy phân đường sữa vào glucose và galactose. ONPG có thể được sử dụng để phát hiện hoạt động β-galactosidase vì nó là chất cơ chất nhiễm sắc thể cho-galactosidase. Nếu tính thấm của màng tế bào thay đổi, ONPG có thể xâm nhập vào tế bào chất và xúc tác-galactosidase để tạo ra các sản phẩm màu vàng. Đỉnh hấp thụ tối đa của các sản phẩm màu vàng này là 415 & nbsp; nm [27]. Do đó, ONPG được chọn làm chất nền cho phản ứng và tính thấm màng bên trong của E. coli được xác định bằng hoạt động β-galactosidase. Trong nghiên cứu này, các tế bào E. coli trong pha logarit trong môi trường LB có chứa 2% đường sữa (với mật độ quang của OD600 là 0,4) đã được thu thập và nối lại bằng bình thường & NBSP; Hệ thống treo tế bào E. coli (200 & NBSP; μL) đã được đưa vào các giếng của một tấm microtiter tiêu chuẩn sau đó thêm ONPG (nồng độ cuối cùng: 1,5 & nbsp; Muffm). Nồng độ khác nhau của LFCIN-B được thêm vào trong mỗi giếng để tạo nồng độ của chúng 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 và 0,5 & NBSP; mg/L. Rung nhẹ ở 37 & nbsp; ° C và sản xuất o-nitrophenol theo thời gian được theo dõi bằng máy quang phổ ở 415 & nbsp; nm.

Biểu hiện kiểm tra và tinh chế peptide kháng khuẩn Lactoferricin B (LFCIN B)

LFCIN B được sử dụng trong nghiên cứu này được thu thập bằng biểu hiện và tinh chế trong phòng thí nghiệm của chúng tôi theo giao thức của Feng [28]. Độ tinh khiết và hoạt động kháng khuẩn của LFCIN B được sản xuất trong phòng thí nghiệm của chúng tôi giống như LFCin B tinh khiết từ quá trình tiêu hóa Pepsin của Bovine bởi Phòng thí nghiệm Khoa học & Công nghệ Thực phẩm Trung ương (Đại học Nông nghiệp Huazhong, Wuhan, Cộng hòa Nhân dân Trung Quốc).

Kết quả

Nồng độ cao của MnCl2 và CaCl2 kèm theo nồng độ nhỏ của LFCIN-B làm tăng năng lực của DH5α

Competent cells are those that have had their cell membranes altered to render it easier to bring foreign DNA inside. Therefore, the permeability of cell membranes is the most important and fundamental condition for competent cell with high transformation efficiency. To improve the transformation efficiency of competent cells, we began to optimize the Inoue method by increasing the permeability of cell membranes. Because the E. coli DH5α strain is the most common competent cell used in DNA cloning experiments, we selected this strain to examine the permeability of the inner and outer layers of the cell membrane. According to the research on antimicrobial peptides which can affect the cell membranes of microorganism such as E. coli [22, 23], we first added three common antimicrobial peptides in LB medium at small concentrations (0.5 mg/mL) to assess their effects on the survival of E. coli DH5α strains. The results showed that the E. coli DH5α clones only grew LB medium and in LB with LFcin-B, but there were significant differences (P < 0.05) between the number of clones. LB medium had more than twice as many as LB-LFcin-B+ (195–213) versus 525–567, Fig. 1a). This indicates that the E. coli DH5α strain could grow on small concentrations (< 0.5 mg/L) of LB-LFcin-B+ medium, which means that LFcin-B can be added to the transformation buffer used to prepare competent cells to obtain cells with strong competence and high permeability. We then examined the variations in permeability of cell membrane caused by different concentrations of LFcin-B. The results of inner and outer cell membrane permeability both showed that the more LFcin-B present, the greater the permeability of the inner and outer cell membrane. We also found the influence on permeability of different concentration can be divided into three groups based on their differences from controls (without LFcin-B): the small effect (P > 0.05) of trace concentrations of LFcin-B (0.1–0.2 mg/L), the significant effect (P < 0.05) caused by small concentrations (0.3–0.4 mg/L) and the huge effect (P < 0.01) caused by normal concentrations (> 0.5 mg/L, Fig. 1b). To establish the influence of LFcin-B on the competence of E. coli DH5α strain, we added the same gradient concentration of LFcin-B into Inoue transformation buffer, and we found that the transformation efficiency of DH5α decreased as the concentration of LFcin-B increased (Fig. 1c). The low transformation efficiency may have been caused by the antibacterial properties of LFcin-B [25]. In the course of next investigation, we found that moderately high concentration of MnCl2 (50 mM) and CaCl2 (30 mM) with slight concentration of LFcin-B (0.35 mg/L) can be stimulatory to transformation by increasing the permeability of cell membrane (Fig. 1d). This may be due to the antibacterial property of LFcin-B can be inhibitory by high concentration of Ca2+ and Mn2+ without losing the increase influence of LFcin-B on DH5α cell membrane, as the mechanism about the antibacterial property of LFcin-B is complex and there remain many unresolved issues [22, 25]. The above observation about the increase in the competence of E. coli in the presence of LFcin-B, Ca2+, and Mn2+ at moderate concentrations suggested that it may improve the preparation of competent cells.

The effect of LFcin-B on the competence of DH5α. a The survival of DH5α grow on LB medium plate with different imicrobial peptides. Three common imicrobial peptides Cecropin A, PR-39 and LFcin-B were added in LB medium plate in normal concentration (0.5 mg/mL). LB medium plate was as control. DH5α strains were grow in these plates overnight at 37°C and then observed, calculated and photographed. b LFcin-B increase the permeability of inner and outer cell membrane determined by NPN assay and ONPG assay. c The increase of LFcin-B decreased the transformation efficiency of DH5α. d Different concentration of MnCl2 and CaCl2 effect the antibacterial property of LFcin-B. Slight concentration of LFcin-B (0.35 mg/L) were added in Inoue method transformation buffer with gradient concentration of MnCl2 and CaCl2, and then calculated the transformation efficiency of DH5α competent cells made by these TB with Inoue method. Each data had three repeats and the bar indicated the SE

The CRM Method Can Produce Better-Quality Competent Cells than Previously Reported Methods

In molecular cloning experiments, transformation efficiency is commonly used as an index to assess the competence of competent cells. CaCl2 and Inoue methods were chosen to compare with CRM method in terms of the quality of competent cells because CaCl2 method was the most widely used chemical method of preparing competent cells in laboratories and the Inoue method can produce stable competent cells in a highly efficient manner [16]. In the first place, the transformation efficiency for pUC19 of three common competent E. coli strains (DH5α, JM109, and TOP10) separately prepared by CaCl2 method, Inoue method and CRM method were calculated and compared. Results showed that the transformation efficiency of all three E. coli competent strains (DH5α, JM109 and TOP10) in this study were similar. The transformation efficiency of CRM method was 3.2–3.5 × 109 cfu/µg for DH5α, 1.8–2.2 × 109 cfu/µg for JM109 and 3.4–3.7 × 109 cfu/µg for TOP10, which were all significantly higher (P < 0.05) than those of the Inoue method (1.9–2.8 × 109 cfu/µg for DH5α, 0.8–1.2 × 109 cfu/µg for JM109 and 2.7–3.1 × 109 cfu/µg for TOP10), and very significantly higher (P < 0.01) than those associated with the CaCl2 method (3.0–3.7 × 107 cfu/µg for DH5α, 3.9–4.3 × 107 cfu/µg for JM109 and 1.6–2.3 × 107 cfu/µg for TOP10). These results indicated that our improved method (CRM method) can be used to make at least three kinds of E. coli competent strains with higher transformation efficiency than the other widely used chemical method (Inoue method and CaCl2 method), and this may be true of other E. coli strains. Electro-transformation is a non-chemical method widely used in molecular cloning experiments due to its high transformation efficiency [2]. We also compared these methods. It gave a transformation efficiency of (2.9–3.6 × 109 cfu/µg for DH5α, 1.7–2.3 × 109 cfu/µg for JM109 and 3.1–3.6 × 109 cfu/µg for TOP10) of pUC19, a value comparable to the frequency (P > 0.5) of CRM method (data not shown). However, electroporation requires special equipment that many laboratories cannot provide. These results indicated that the CRM method can produce competent E. coli cells with high transformation efficiency (1.8–3.7 109 cfu/µg), much higher than other chemical transformation and comparable to electro-transformation, indicating that it is sufficient for the genetic transformation necessary to create high-quality competent cells (Fig. 2).

The transformation efficiency (TE) of three E. coli competent cells (DH5α, TOP10 and JM109) made by different methods. Bars represent standard error (n = 3). One and double asterisks above the columns indicated significant difference at p < 0.05 and p < 0.01 separately

In modern molecular biology, increasing numbers of experiments require insertion of target DNA fragments into specific plasmids using PCR, restriction enzyme digestion, ligation reactions, and transformation. The larger the target DNA fragment, the fewer positive clones are obtained. To investigate the competent cells prepared by CRM method has better ability to transfer large target DNA fragments than other methods. A 8105 bp ligation product which connected a 5100 bp gene fragment (AT3G52250.1) with a 3015 bp double digestion pGEM-Teasy vector fragment was transferred using different competent cells prepared using different methods. The transformants were selected on LB agar containing IPTG, X-gal, and ampicillin. Blue and white colonies were observed after overnight incubation. White colonies indicate positive transformed colonies with target DNA fragments and blue colonies indicate negative colonies that do not contain the target DNA fragment. Results show that, among three DH5α strains prepared using different methods, only the CRM method gave positive results. No transformants appeared in CaCl2 method plate, and there were only negative colonies (blue) in Inoue method plate (Fig. 3a). As no positive colonies were observed on the Inoue and CaCl2 method plates, we were not able to perform statistical analysis of these data. Two white transformants from CRM method plate and two blue transformants were randomly chosen to extract plasmids. These plasmids were subjected to PCR and enzyme digestion for confirmation of target DNA insertion in plasmids. The result of PCR and enzyme digestion both confirmed that the target DNA were successfully inserted into plasmid only by competent cell using CRM method (Fig. 3b, c). Further sequence reaction also proved this (data not shown). These results indicated that the competent cells prepared using the CRM method was best for inserting larger (> 5000 bp) target DNA fragments into plasmid vector than other competent cells were. This may be because of the increased cell membrane permeability attributable to addition of LFcin-B. Results indicate that the CRM method can not only produce competent E. coli cells with better transformation efficiency than other chemical methods, comparable to the electro-transformation method, and it can also produce highly competent E. coli cells, which are extremely efficient for incorporating larger DNA fragments into plasmid vectors.

Inserting larger size of target DNA fragment into plasmids by different E. coli competent cells. a Blue-white spot screening experiment of a 8105 bp ligation product using different E. coli competent cells. White colonies indicate positive transformed colonies with target DNA fragment and blue one indicate negative colonies without target DNA fragment. b PCR assay for confirmation of target DNA insertion in plasmid. Line 1 and 2 were the gel electrophoresis results of CRM method PCR products, line 3 was the marker, line 4 and 5 were the gel electrophoresis results of Inoue method PCR products. c Enzyme digestion assay for confirmation of target DNA insertion in plasmid. Line 1 and 6 were marker. Line 2 and 3 were the gel electrophoresis results of CRM method enzyme digestion products, line 4 and 5 were the gel electrophoresis results of Inoue method enzyme digestion products

Discussion

Cloning PCR products into plasmid vectors is a common and necessary upstream application for most modern molecular cloning experiments. Transformation efficiency is very important because it can directly affect the success of all the follow-up assays, and it can be affected by factors such as the quality of competent cells. Electroporation, which has high transformation efficiency requires special and expensive equipment [9, 10], so the establishment of a convenient and rapid chemical method of transformation for all E. coli bacterial strains and large DNA fragments is necessary and important to the development of modern molecular biology. As the increasing reports on the non-lethal effect of some antimicrobial peptide by increasing the permeability of cell membrane [22, 23], we here improved upon the Inoue method by adding various common antimicrobial peptides found in mammals [22]. We found one antimicrobial peptide, LFcin-B, to have a non-lethal effect on E. coli DH5α strains. Through repeated attempts, we found that the low transformation efficiency caused by LFcin-B’s antibacterial property [25] can be increased by adding moderate high concentration of MnCl2 (50 mM) and CaCl2 (30 mM). This may be because the antibacterial properties of LFcin-B can be inhibited by high concentrations of Ca2+ and Mn2+ without losing the increasing permeability of the DH5α cell membrane [22, 25]. Although the mechanism underlying the antibacterial properties of LFcin-B is complex and still remain unclear, the observation can utilized to obtain competent cells with high competence which is urgently necessary in modern molecular cloning experiments because the permeability of the cell membrane directly influences the competence of E. coli cells. We are the first team to prepare highly competent cells by adding moderate concentrations of LFcin-B. Further assays indicated that CRM method with its small concentration of LFcin-B (0.35 mg/L) with moderately high concentrations of MnCl2 (50 mM) and CaCl2 (30 mM) can also increase the transformation efficiency of other two common E. coli strains, JMI09 and TOP10. These results indicated that CRM method can applied to produce high quality competent cells of most common E. coli cells which means this method can be widely used. Compared with other chemical methods (CaCl2 and Inoue), CRM can produce competent E. coli cells with much higher transformation efficiency than those produced with other methods (1.8–3.7 × 109 cfu/µg), comparable to electro-transformation. The best-known protocol for preparing competent E. coli cells and chemical transformation is the CaCl2 method published by Mandel and Higa [8]. This method is still widely used in many laboratories due to its convenience. Another good chemical methods was described by Inoue [11] because its transformation efficiency has been carefully optimized through a great number of studies [3, 15, 29–31]. The basic steps of this technique have undergone a few modifications for optimizing the efficiency of transformation, the majority of these efforts were indeed able to enhance the transformation efficiencies but the increase depended on suitable smaller DNA and differences among E. coli bacterial strains [10, 32, 33]. Unlike this methods, CRM method can increase the transformation efficiencies at least three common strains of E. coli cells, which strongly suggests it may be applied in most E. coli cells, and the huge increased transformation efficiencies exceed the maximum previous report. Moreover, the competent cells prepared by CRM method not only have high transformation efficiency, which is sufficient for modern molecular experiments but also have an especially good ability to insert larger DNA fragments into plasmid vectors, which Inoue and other transformation methods do not tend to offer. With the increasing development of genetic recombination technology, the most convenient and effective pathway to producing LFcin-B protein has been expression recombinant target protein in vitro [34]. At present, there are four major systems for production recombinant protein in vitro. These are the prokaryotic protein expression system, mammalian cell protein expression system, yeast protein expression system, and insect cell protein expression system [35]. According to previous reports, it is possible to produce good-quality LFcin-B protein via prokaryotic protein expression system and yeast protein expression system [28, 36–39]. Producing recombinant LFcin-B protein through prokaryotic protein expression systems is more welcome both in research and industrial production because E. coli has a clear genetic background and strong tolerance to many proteins, which means high levels of expression of the target proteins can be induced under appropriate conditions [28, 38]. Producing LFcin-B protein using the prokaryotic expression system offers convenient operation, low cost, fast speed, and large-scale, high-quality expression. Adding small concentration of LFcin-B is not expensive or troublesome, and the cost of CRM method in both time and money are similar to those of other chemical methods, but the transformation efficiencies and level of competence of competent cells can be significantly increased by the CRM method.

Tóm lại, chúng tôi đã mô tả một giao thức để chuẩn bị các tế bào E. & NBSP; coli có thẩm quyền phù hợp nhất để chuyển đổi plasmid hiệu quả và chèn các đoạn DNA lớn hơn vào các vectơ plasmid trong nghiên cứu này. Nhân bản các sản phẩm PCR vào các vectơ plasmid là một ứng dụng ngược dòng phổ biến của nhiều nghiên cứu phân tử hiện đại như CO-IP và BIFC [26]. Phương pháp của chúng tôi là đơn giản, đáng tin cậy và có khả năng tái sản xuất cao. Nó hoạt động cho ít nhất ba chủng E. & NBSP; coli (DH5α, JMI09 và Top10) và có thể các chủng E. & NBSP; coli khác. Các kết quả được báo cáo ở đây có thể hữu ích cho các nghiên cứu sinh học khác nhau.

Sự nhìn nhận

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Tổ chức Khoa học Tự nhiên của Tỉnh Hubei (cấp số 2016CFB630), nghiên cứu cơ bản cho dự án ứng dụng của WUHAN (Grant số 2015011701011595) và Quỹ khoa học tự nhiên quốc gia Trung Quốc (NSFC31701100, NSFC31600981, NSFC316 Chúng tôi cũng xin cảm ơn Letpub (www.letpub.com) đã cung cấp hỗ trợ ngôn ngữ trong quá trình chuẩn bị bản thảo này.

Người giới thiệu

1. Reid GA. Nhân bản phân tử: Hướng dẫn sử dụng phòng thí nghiệm, lần thứ 2: Tác giả J. Sambrook, E. F. Fritsch và T. Maniatis, Nhà xuất bản Phòng thí nghiệm Cảng Cold Spring, 1989. $ 115,00 (3 vols; 1659 trang) ISBN 0 87969 309 6. Xu hướng Biotechnol. 1991; 9: 213 Từ214. doi: & nbsp; 10.1016/0167-7799 (91) 90068-s. [CrossRef] [Học giả Google]Reid GA. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn: by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. $115.00 (3 vols; 1659 pages) ISBN 0 87969 309 6. Trends Biotechnol. 1991;9:213–214. doi: 10.1016/0167-7799(91)90068-S. [CrossRef] [Google Scholar]

2. DOWER WJ, Miller JF, Ragsdale CW. Chuyển đổi hiệu quả cao của E. coli bằng điện điện áp cao. Axit nucleic res. 1988; 16: 6127. doi: & nbsp; 10.1093/nar/16.13.6127. [Bài viết miễn phí PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 1988;16:6127. doi: 10.1093/nar/16.13.6127. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

3. Hanahan D. Các nghiên cứu về sự biến đổi của Escherichia coli với plasmid. J Mol Biol. 1983; 166: 557 Từ580. doi: & nbsp; 10.1016/s0022-2836 (83) 80284-8. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 1983;166:557–580. doi: 10.1016/S0022-2836(83)80284-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. McCormac AC, Elliott MC, Chen DF. Một phương pháp đơn giản để sản xuất các tế bào Agrobacterium có khả năng cao để chuyển đổi thông qua điện hóa. Công nghệ sinh học mol. 1998; 9: 155. doi: & nbsp; 10.1007/bf02760816. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Mccormac AC, Elliott MC, Chen DF. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Mol Biotechnol. 1998;9:155. doi: 10.1007/BF02760816. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. Okamoto A, Kosugi A, Koizumi Y, Yanagida F, Udaka S. Chuyển đổi hiệu quả cao của Bacillus brevis bằng cách điện. Biosci Biotechnol Biochem. 1997; 61: 202 Từ203. doi: & nbsp; 10.1271/bbb.61.202. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Okamoto A, Kosugi A, Koizumi Y, Yanagida F, Udaka S. High efficiency transformation of Bacillus brevis by electroporation. Biosci Biotechnol Biochem. 1997;61:202–203. doi: 10.1271/bbb.61.202. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

6. Yi Y, Kuipers Op. Phát triển một phương pháp điện hóa hiệu quả cho các chủng mycoides trực khuẩn rhizobacterial. J Phương pháp Microbiol. 2017; 133: 82 bóng86. doi: & nbsp; 10.1016/j.mimet.2016.12.022. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Yi Y, Kuipers OP. Development of an efficient electroporation method for rhizobacterial Bacillus mycoides strains. J Microbiol Methods. 2017;133:82–86. doi: 10.1016/j.mimet.2016.12.022. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

7. Luo J, Xue H, Zhao S, Liu X, Chen X, Liu J, Shen Y, Wang M (2018) Tối ưu hóa điện hóa. ADV Appl Biotechnol 393Luo J, Xue H, Zhao S, Liu X, Chen X, Liu J, Shen Y, Wang M (2018) Optimization of electroporation. Adv Appl Biotechnol 393

8. Mandel M, Higa A. Nhiễm DNA vi khuẩn phụ thuộc canxi ☆ j mol biol. 1970; 53: 159 Từ162. doi: & nbsp; 10.1016/0022-2836 (70) 90051-3. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Mandel M, Higa A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection ☆ J Mol Biol. 1970;53:159–162. doi: 10.1016/0022-2836(70)90051-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

9. Cohen SN, Chang Acy, Boyer HW, Helling RB. Xây dựng các plasmid vi khuẩn chức năng sinh học trong ống nghiệm. Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 24: 188. [Học giả Google]Cohen SN, Chang ACY, Boyer HW, Helling RB. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;24:188. [Google Scholar]

10. Giáo hoàng B, Kent HM. Hiệu quả cao 5 & NBSP; Chuyển đổi tối thiểu Escherichia coli. Axit nucleic res. 1996; 24: 536. doi: & nbsp; 10.1093/nar/24.3.536. [Bài viết miễn phí PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]Pope B, Kent HM. High efficiency 5 min transformation of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 1996;24:536. doi: 10.1093/nar/24.3.536. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

11. Inoue H, Nojima H, Okayama H. ​​Chuyển đổi hiệu quả cao của Escherichia coli với plasmid. Gen. 1990; 96: 23. doi: & nbsp; 10.1016/0378-1119 (90) 90336-p. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 1990;96:23. doi: 10.1016/0378-1119(90)90336-P. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

12. Nakata Y, Tang X, Yokoyama KK. Chuẩn bị các tế bào có thẩm quyền để chuyển đổi plasmid hiệu quả cao của Escherichia coli. Phương pháp Mol Biol. 1997; 69: 129. [PubMed] [Học giả Google]Nakata Y, Tang X, Yokoyama KK. Preparation of competent cells for high-efficiency plasmid transformation of Escherichia coli. Methods Mol Biol. 1997;69:129. [PubMed] [Google Scholar]

13. Si SJ, Liu TF, Lei XC. Tối ưu hóa điều kiện để chuẩn bị các tế bào có thẩm quyền của E. coli thiếu methylase với hiệu quả chuyển đổi cao. Cái cằm. J Biol. 2010; 23: 533 Từ535 & NBSP;+& NBSP; 538. [Học giả Google]Si SJ, Liu TF, Lei XC. Optimization of condition for preparation of competent cells of methylase-deficiency E. coli with high transformation efficiency. Chin. J Biol. 2010;23:533–535 + 538. [Google Scholar]

14. AFR J Biotechnol. 2010; 9: 8549 Từ8554. [Học giả Google]Li X, Sui X, Zhang Y, Sun Y, Zhao Y, Zhai Y, Wang Q. An improved calcium chloride method preparation and transformation of competent cells. Afr J Biotechnol. 2010;9:8549–8554. [Google Scholar]

15. Taketo A, Kuno S. Độ nhạy của Escherichia coli với axit nucleic virus VII. Các nghiên cứu sâu hơn về năng lực do Ca2+gây ra. J Biochem. 1974; 75: 59 Từ67. doi: & nbsp; 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a130383. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Taketo A, Kuno S. Sensitivity of Escherichia coli to viral nucleic acid VII. Further studies on Ca2+-induced competence. J Biochem. 1974;75:59–67. doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a130383. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

16. Green MR, Sambrook J. Phương pháp Hanahan để chuẩn bị và chuyển đổi Escherichia coli có thẩm quyền: Chuyển đổi hiệu quả cao. 3. New York: Giao thức Cảng mùa xuân lạnh; 2018. [PubMed] [Google Scholar]Green MR, Sambrook J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. 3. New York: Cold Spring Harbor Protocols; 2018. [PubMed] [Google Scholar]

17. Chen X, Guo P, Xie Z, Shen P. Một phương pháp thuận tiện và nhanh chóng để biến đổi di truyền của E. coli với plasmid. Antonie Van Leeuwenhoek. 2001; 80: 297. doi: & nbsp; 10.1023/a: 1013040812987. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Chen X, Guo P, Xie Z, Shen P. A convenient and rapid method for genetic transformation of E. coli with plasmids. Antonie Van Leeuwenhoek. 2001;80:297. doi: 10.1023/A:1013040812987. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

18. Electron J Biotechnol. 2005; 8: 113 Từ120. [Học giả Google]Tu Z, He G, Li KX, Chen MJ, Chang J, Chen L, Yao Q, Liu DP, Ye H, Shi J. An improved system for competent cell preparation and high efficiency plasmid transformation using different Escherichia coli strains. Electron J Biotechnol. 2005;8:113–120. [Google Scholar]

19. Sharma A, Girdhar A, Srivastava N, Sharma A, Girdhar A, Srivastava N. Phát triển chiến lược để chuẩn bị tế bào có thẩm quyền và chuyển đổi plasmid hiệu quả cao bằng các phương pháp khác nhau. S Pac J Nat Appl Sci. 2012; 29: 17 Từ20. [Học giả Google]Sharma A, Girdhar A, Srivastava N, Sharma A, Girdhar A, Srivastava N. Development of strategy for competent cell preparation and high efficiency plasmid transformation using different methods. S Pac J Nat Appl Sci. 2012;29:17–20. [Google Scholar]

20. Carrillo C, Giraldo M, Cavia MM, Alonso-Torre SR. Tác dụng của axit oleic đối với sự xâm nhập canxi vận hành trong các tế bào có khả năng miễn dịch. Eur J Nutr. 2017; 56: 1077 Từ1084. doi: & nbsp; 10.1007/s00394-016-1157-5. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Carrillo C, Giraldo M, Cavia MM, Alonso-Torre SR. Effect of oleic acid on store-operated calcium entry in immune-competent cells. Eur J Nutr. 2017;56:1077–1084. doi: 10.1007/s00394-016-1157-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

21. Wang S, Li Z, Chen Z. Chemotransformation của các tế bào vi khuẩn không có sốc nhiệt. Chem Res Chin Univ. 2017; 33: 160 Từ165. doi: & nbsp; 10.1007/s40242-017-6403-8. [CrossRef] [Học giả Google]Wang S, Li Z, Chen Z. Chemotransformation of bacterial cells without heat-shock. Chem Res Chin Univ. 2017;33:160–165. doi: 10.1007/s40242-017-6403-8. [CrossRef] [Google Scholar]

22. Kiểm soát peptide kháng khuẩn đối với các vi sinh vật gây bệnh của khoang miệng: đánh giá các tài liệu. Peptide. 2012; 36: 315 bóng321. doi: & nbsp; 10.1016/j.peptides.2012.05.015. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]da Silva B, de Freitas VA, Nascimentoneto LG, Carneiro VA, Arruda FV, de Aguiar AS, Cavada BS, Teixeira EH. Antimicrobial peptide control of pathogenic microorganisms of the oral cavity: a review of the literature. Peptides. 2012;36:315–321. doi: 10.1016/j.peptides.2012.05.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

23. Brogden Ka. Peptide kháng khuẩn: Các chất tạo dạng lỗ chân lông hoặc chất ức chế chuyển hóa ở vi khuẩn? Nat Rev Microbiol. 2005; 3: 238. doi: & nbsp; 10.1038/nrmicro1098. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Brogden KA. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol. 2005;3:238. doi: 10.1038/nrmicro1098. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

24. Montales KP, Wade HM, Figueroa DM, Darling Le, Elmore DE. Đặc trưng cho những thay đổi trong cơ chế peptide kháng khuẩn chống lại các chủng vi khuẩn khác nhau. Biophys J. 2018; 114: 456a. doi: & nbsp; 10.1016/j.bpj.2017.11.2518. [CrossRef] [Học giả Google]Montales KP, Wade HM, Figueroa DM, Darling LE, Elmore DE. Characterizing changes in antimicrobial peptide mechanism against different bacterial strains. Biophys J. 2018;114:456a. doi: 10.1016/j.bpj.2017.11.2518. [CrossRef] [Google Scholar]

25. Arch Dược Res. 2014; 38: 261. doi: & nbsp; 10.1007/s12272-014-0373-x. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Wang S, Tu J, Zhou C, Li J, Huang L, Tao L, Zhao L. The effect of Lfcin-B on non-small cell lung cancer H460 cells is mediated by inhibiting VEGF expression and inducing apoptosis. Arch Pharmacal Res. 2014;38:261. doi: 10.1007/s12272-014-0373-x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

26. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Nhân bản phân tử: Hướng dẫn phòng thí nghiệm 1989. 2. New York: Phòng thí nghiệm Cảng mùa xuân lạnh; 1989. [Học giả Google]Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual 1989. 2. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1989. [Google Scholar]

27. Biochim Biophys Acta (BBA) Gen Subj. 2000; 1523: 196 bóng205. doi: & nbsp; 10.1016/s0304-4165 (00) 00122-7. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Ibrahim HR, Sugimoto Y, Aoki T. Ovotransferrin antimicrobial peptide (OTAP-92) kills bacteria through a membrane damage mechanism. Biochim Biophys Acta (BBA) Gen Subj. 2000;1523:196–205. doi: 10.1016/S0304-4165(00)00122-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

28. Protein expr purif. 2006; 47: 110 Từ117. doi: & nbsp; 10.1016/j.pep.2005.08.016. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]X-j Feng, J-h Wang, A-s Shan, Teng D, Y-l Yang, Yao Y, G-p Yang, Y-c Shao, Liu S, Zhang F. Fusion expression of bovine lactoferricin in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2006;47:110–117. doi: 10.1016/j.pep.2005.08.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

29. Lederberg EM, Cohen SN. Sự biến đổi của salmonella typhimurium bằng axit plasmid deoxyribonucleic. J Bacteriol. 1974; 119: 1072 Từ1074. [Bài viết miễn phí PMC] [PubMed] [Google Scholar]Lederberg EM, Cohen SN. Transformation of Salmonella typhimurium by plasmid deoxyribonucleic acid. J Bacteriol. 1974;119:1072–1074. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

30. Jones IM, Primrose SB, Robinson A, Ellwood DC. Ảnh hưởng của tốc độ tăng trưởng và giới hạn chất dinh dưỡng đến khả năng biến đổi của Escherichia coli với axit plasmid deoxyribonucleic. J Bacteriol. 1981; 146: 841. [Bài viết miễn phí PMC] [PubMed] [Google Scholar]Jones IM, Primrose SB, Robinson A, Ellwood DC. Effect of growth rate and nutrient limitation on the transformability of Escherichia coli with plasmid deoxyribonucleic acid. J Bacteriol. 1981;146:841. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

31. Morrison da. Chuyển đổi và bảo tồn các tế bào vi khuẩn có thẩm quyền bằng cách đóng băng. Phương pháp enzymol. 1979; 68: 326 Từ331. doi: & nbsp; 10.1016/0076-6879 (79) 68023-0. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Morrison DA. Transformation and preservation of competent bacterial cells by freezing. Methods Enzymol. 1979;68:326–331. doi: 10.1016/0076-6879(79)68023-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

32. Hanahan D, Jessee J, Bloom Fr. Chuyển đổi plasmid của Escherichia coli và các vi khuẩn khác. Phương pháp enzymol. 1991; 204: 63. doi: & nbsp; 10.1016/0076-6879 (91) 04006-A. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 1991;204:63. doi: 10.1016/0076-6879(91)04006-A. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

33. D Breathra G, Kumari R, Bala S, Majumdar S, Malhotra S, Sharma P, Lal S, Cullum J, Lal R. Phát triển các vectơ nhân bản và phương pháp chuyển đổi cho amycolatopsis. J Ind Microbiol Biotechnol. 2003; 30: 195 Từ204. doi: & nbsp; 10.1007/s10295-003-0040-6. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Dhingra G, Kumari R, Bala S, Majumdar S, Malhotra S, Sharma P, Lal S, Cullum J, Lal R. Development of cloning vectors and transformation methods for Amycolatopsis. J Ind Microbiol Biotechnol. 2003;30:195–204. doi: 10.1007/s10295-003-0040-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

34. Kozlov SA, Vassilevski AA, Grishin EV. Cấu trúc tiền thân peptide kháng khuẩn gợi ý các chiến lược sản xuất hiệu quả. Gần đây Vụ gây dị ứng V viêm. 2008; 2: 58 Từ63. doi: & nbsp; 10.2174/187221308783399261. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Kozlov SA, Vassilevski AA, Grishin EV. Antimicrobial peptide precursor structures suggest effective production strategies. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov. 2008;2:58–63. doi: 10.2174/187221308783399261. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

35. Li Y. Sản xuất tái tổ hợp các peptide kháng khuẩn ở Escherichia coli: một đánh giá. Protein expr purif. 2011; 80: 260 bóng267. doi: & nbsp; 10.1016/j.pep.2011.08.001. [PubMed] [CrossRef] [Học giả Google]Li Y. Recombinant production of antimicrobial peptides in Escherichia coli: a review. Protein Expr Purif. 2011;80:260–267. doi: 10.1016/j.pep.2011.08.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

36. Fenglong M. Nghiên cứu về sự tổng hợp gen lactoferricin (LFCIN B) và biểu hiện của nó trong microzyme. J Anhui nông nghiệp Sci. 2008; 36: 446. [Học giả Google]Fenglong M. Study on the synthesis of lactoferricin bovine (Lfcin B) gene and its expression in microzyme. J Anhui Agric Sci. 2008;36:446. [Google Scholar]

37. Wu J, Han Y, Liu K, Zhang Y, Liu Y. Lfcinb gen đột biến được nhân bản trong biểu hiện hợp nhất Escherichia coli và xác định hoạt động. Công nghệ sinh học Bull. 2010; 03: 85 Vang89. [Học giả Google]Wu J, Han Y, Liu K, Zhang Y, Liu Y. LfcinB mutant gene cloned in Escherichia coli fusion expression and activity determ ination. Biotechnol Bull. 2010;03:85–89. [Google Scholar]

38. Xing F, Yin Y, Huang R, Kong X, Li T, Tang Z, Zhang Y. Biểu hiện của lactoferricin B tái tổ hợp ở E. coli. Khoa học thực phẩm. 2008; 29: 221 Từ224. [Học giả Google]Xing F, Yin Y, Huang R, Kong X, Li T, Tang Z, Zhang Y. Expression of recombinant lactoferricin B in E. coli. Food Sci. 2008;29:221–224. [Google Scholar]

39. Yi J, Huang D, Li L, Lin F. Biểu hiện và xác định gen lfcinb trong pichia pastoris. Microbiol Trung Quốc. 2007; 34: 7 trận11. [Học giả Google]Yi J, Huang D, Li L, Lin F. Expression and identification of LfcinB gene in Pichia pastoris. Microbiol China. 2007;34:7–11. [Google Scholar]

Các bài báo từ Tạp chí Vi sinh Ấn Độ được cung cấp ở đây lịch sự của SpringerIndian Journal of Microbiology are provided here courtesy of Springer